Kvalita DNA velmi silně ovlivňuje výsledek přípravy knihovny a výtěžek sekvenace na sekvenátorech Pacific Biosciences. Pro tyto sekvenátory je bezpodmínečně nutné, aby vstupní DNA byla v co nejvyšší kvalitě a odpovídajícím množství. Cílem přípravy vzorku je co nejméně fragmentovaná DNA co nejvyšší čistoty.
Pokyny uvedené níže jsou podmínkou dosažení nejlepšího výsledku sekvenace:
Poznámky:
gDNA pro assembly musí mít co nejvyšší kvalitu, jinak hrozí riziko vzniku chimér sense/antisense a nerovnoměrné pokrytí genomu (a nekompletní assembly). Na obrázku je vysoce kvalitní gDNA (dráhy 1 a 2), získaná pomocí MagAttract HMW DNA kitu (Qiagen). Obecně doporučujeme vycházet při izolaci z minimálního nutného množství počátečního materiálu, kvalitu izolátu kontrolovat okamžitě, připravit alikvoty a ihned uložit:
|
|
Amplikony je lépe dodat spíše delší než kratší (>1000 bp), jinak může dojít k jejich nerovnoměrnému loadingu a k poklesu účinnosti loadingu obecně. Sekvenační výstup pro amplikony <1000 bp je výrazně nižší! |
|