Kdybych dostal zaplaceno pokaždé, když odpovídáme na otázku “Jak mám měřit koncentraci DNA nebo RNA na přípravu NGS knihovny?”, tak bych nepsal tento příspěvek. Byl bych někde na jachtě okolo řeckých ostrovů. Ale jelikož na žádné jachtě nejsem, říkal jsem si, že bych mohl dát dohromady několik dobrých důvodů, proč není používání Nanodropu pro tyto účely zrovna ten nejlepší nápad.

Zaprvé, Nanodrop – jako všechny spektrofotometry – není specifický. Je celkem vhodný na měření poměrů 260/280 nebo 260/230 a dá vám informaci o možných kontaminantech ve vašich vzorcích, třeba o přítomnosti fenolu. Ale při 260 nm absorbuje příliš mnoho látek, abyste těm číslům mohli věřit, a nelze rozlišit DNA od RNA. Naproti tomu eseje na Qubitu jsou specifické pro DNA nebo RNA. Už jsme viděli i vzorky, kvantifikované na Nanodropu, které měly obsahovat nukleové kyseliny, ale žádné tam nebyly a veškerá absorbance byla způsobena přítomnými kontaminacemi. S Qubitem takovou chybu neuděláte.

Zadruhé, citlivost. Podle mých zkušeností se s Nanodropem nedostanete níže než na desítky nanogramů na mikrolitr. Jakákoliv nižší naměřená koncentrace je nedůvěryhodná. Pokud připravujete vzorky na NGS knihovny a vaše vzorky mají nízké koncentrace – a podle našich zkušeností mnoho klientů má vzorky s nízkou koncentrací – pak je Qubit nenahraditelný pro to, abyste věděli, jak nízká ta koncentrace je a zda ve vzorku vůbec máte nějakou DNA nebo RNA! Např. Qubit HS assay vám dá poměrně přesné výsledky i pro koncentrace v řádu desítek pikogramů, což je o tři řády nižší citlivost, než má Nanodrop.

Zatřetí, pipetovací objem. Používáte-li Nanodrop, můžete měřit s 1 ul vzorku. Samozřejmě můžete použít větší objem, ale ruku na srdce – pokud protokol říká, že můžete použít pouze 1 ul vašich cenných vzorků a současně víte, že měřitelné minimum jsou desítky nanogramů, vsadím se, že to uděláte. A jelikož nikdo z nás nekalibruje pipety každý den, můžete tomuto 1 ul skutečně věřit? Mimochodem, musím přiznat, že i na Qubitu můžete pracovat s 1 ul vzorku, ale zaprvé vám to určitě nedoporučuji, zadruhé je citlivost někde úplně jinde a zatřetí to aspoň nepoužívají jako prodejní argument, když ten přístroj kupujete. Pro Nanodrop je to historicky jeden z hlavních prodejních argumentů a znám příliš mnoho laboratoří, které na tuhle návnadu skočily.

Začtvrté, Nanodrop je výrazně dražší. Vám je to možná jedno, ale vašemu šéfovi ne.

A na závěr, pokud vás moje argumenty nepřesvědčily, podívejte se na publikaci Kapp et al. Ta by měla myslím přesvědčit úplně každého. Asi bych chtěl ještě uvést, že my vaše vzorky samozřejmě přeměříme na Qubitu. Ale jestli jste dočetli až sem, tak jsem si tu předposlední větu mohl odpustit.

NGS Lab, ngs@seqme.eu

Reference:

Kapp JR, Diss T, Spicer J, et al; Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial; Journal of Clinical Pathology 2015; 68:111-118.