V minulém článku jsme popsali některé vlastnosti a z toho plynoucí limitace sekvenátoru Sequel (Pacific Biosciences). Pokud hledáte alternativu k této technologii dlouhých readů, možná zvažujete technologii firmy Oxford Nanopore, která aktuálně nabízí několik sekvenátorů, lišících se v zásadě hlavně kapacitou. Nejmenším přístrojem je systém MinION. Společnost SEQme nabízí sekvenování na systému GridION, což je takový větší bratr populárního MinIONu.

Technologie Oxford Nanopore se vyvíjí opravdu rychle a její pokroky nenechávají nikoho na pochybách, že překonala stádium technologie „nedůvěryhodné“, protože generující data s nízkou kvalitou. Rozhodně vám ji doporučujeme ke zvážení, pochopitelně hlavně v případech, kdy vám již nestačí krátké ready generované vládcem trhu Illumina. Nicméně, i nadále u Oxford Nanopore přetrvávají určité limitace a následující článek se snaží ty hlavní shrnout.

Podobně jako u systému Sequel i zde je sekvenační výstup (objem dat) významně určen délkou fragmentů vstupního materiálu. Sekvenovat lze amplikony, transkripty či genomovou DNA různých délek. Sekvenace na systému GridION je navíc velmi citlivá na specifické inhibitory, které mohou vyřadit z provozu menší, či větší počet nanopórů a tím snižovat sekvenační výstup.

Za optimálních podmínek je výstupní kapacita systémů Oxford Nanopore určena množstvím aktivních pórů a dobou sekvenace. Doba sekvenace je veličina, kterou lze v rámci maximální doby sekvenace rozdělit mezi více vzorků. V praxi to znamená, že sekvenaci lze spustit a ve chvíli, kdy si myslíme, že máme dostatečné množství dat, lze ji zastavit, sekvenační čip (flowcell) promýt a sekvenovat další vzorek na témže čipu až do celkové maximální doby, kterou zvládne. Po nějaké době sekvenace ztratí efektivitu a nemá cenu již dále pokračovat.

Pokles sekvenačního výstupu v čase pro systém MinION

Doba sekvenace, tedy doba po kterou jsou póry aktivní, je předmětem velmi progresivního vývoje, což se promítá do růstu maximálního sekvenačního výstupu. Společně s dalším rychle se vyvíjejícím parametrem, kterým je zvyšující se rychlost sekvenace, dochází k neustálému zvyšování kapacity sekvenačních čipů:

Vývoj kapacity čipů MinION/GridION

Vzhledem k tomuto velmi rychlému vývoji zde neuvádím konkrétní čísla. Nicméně bez ohledu na rychlost vývoje jsou proměnné, které ovlivňují sekvenační výstup, stále stejné a patří mezi ně zejména:

• komplexita DNA – organismus, tkáň, stáří vzorku
• epigenetické modifikace – nativní DNA se sekvenuje výrazně hůře než DNA, jež prošla byť jen několika cykly PCR
• čistota templátu - přítomnost inhibitorů

Přesnost sekvenace se od počátku právem potýká se špatnou pověstí, nicméně i v této oblasti společnost Oxford Nanopore tlačí na neustálé zlepšování. Prošla si několika slepými uličkami, kterými byly 2D a 1D² čtení, které si kladly za cíl získat sekvenci z obou komplementárních vláken a jejich porovnání eliminovat chybovost. V obou případech se ale technologie potýkala s problémem, že pouze nízké procento readů bylo produktem těchto strategií, zatímco většina readů byla tzv. 1D. Obě tyto strategie byly opuštěny, přestože k vyšší přesnosti čtení dopomáhaly.

Strategie, která se naopak společnosti Oxford Nanopore osvědčila, a která vede ke kontinuálnímu zlepšování kvality čtení, je vývoj algoritmů, které převádí signál na báze – provádí tzv. basecalling. Unikátní oproti ostatním sekvenačním technologiím je možnost uložení dat ve formě záznamu signálu (byť jsou tato data velice objemná) a opakování basecallingu s aktuálně nejnovější verzí softwaru. Můžete tedy vlastně lépe číst stará data, podobně jako když jste v mládí četli knihu, které jste nerozuměli, a ke které se vrátíte později.

Všechny tyto vlastnosti a prudký technologický vývoj nás vedou k tomu, že GridION a technologii jako takovou můžeme s klidným svědomím doporučit. Stále platí, že přesnost se jen pracně šplhá přes 90%, ale i přesto se jedná o technologii, která je již zcela použitelná pro řadu aplikací, zejména v kombinaci s daty produkovanými jinou technologií (typicky Illumina).

Obrázky převzaty z materiálů Oxford Nanopore.

NGS Lab, ngs@seqme.eu