Zcela běžnou součástí sekvenačního elektroferogramu je kvalitativně zhoršený (respektive nečitelný) úplný začátek sekvence. Zatímco sekvence použitého primeru ani nemůže být zobrazena, neboť syntéza a tedy i značení sekvenačního produktu začíná na jeho 3’-konci, první očekávanou zobrazitelnou bází by teoreticky mohla být první báze za sekvenačním primerem. Ve skutečnosti však zpravidla přibližně 20 bází za primerem nelze spolehlivě přečíst, což může být problematické zejména v případech, kdy se v tomto úseku nebo bezprostředně za ním nachází oblast zájmu, či u analýz velmi krátkých fragmentů.

Důvodem jsou jednoduše technické možnosti Sangerova sekvenování, zejména ta skutečnost, že jednotlivé značené terminátorové nukleotidy běžně používaných sekvenačních kitů BigDye Terminator mají různou molekulovou hmotnost a náboj, což se během elektroforézy velmi krátkých fragmentů projeví výraznými posuny jejich migrace (u delších migrujících fragmentů se tyto rozdíly téměř eliminují, respektive jsou zanedbatelné). V této souvislosti jistou roli hraje i to, že kapilární elektroforéza v automatických  sekvenátorech za použití polymeru jako separační matrice není optimalizována pro rozlišení příliš krátkých řetězců, které migrují nejrychleji.

Je-li tedy zapotřebí získat kvalitní sekvenci těsně za sekvenačním primerem, je standardně doporučováno obousměrné sekvenování za použití forward i reverse primerů, event. použití primeru s přesahem na 5´konci (typicky za využití sekvence některého z univerzálních primerů), popřípadě zaklonování  daného fragmentu do plazmidu a čtení pomocí primerů nasedajících v dostatečné vzdálenosti od klonovacího místa.

Jako rychlou, snadnou a spolehlivou alternativu shora uvedeného postupu vám však můžeme doporučit použití sekvenačního primeru opatřeného specifickým tagem kovalentně vázaným na 5´konci. Přítomnost tohoto tagu umožňuje kvalitnější čtení sekvence bezprostředně za jakýmkoliv primerem, na jehož konec je navázán, a je tedy nutné na to myslet již v rámci syntézy daného primeru (ne všichni dodavatelé primerů tuto službu nabízí). Nic dalšího ovšem není potřeba, postačí jednosměrná sekvenace, žádné klonování  a další shora uvedené postupy nejsou nutné – pouhá přítomnost tagu zajistí, že sekvenace je perfektní hned od první báze.

Příklad vidíte na obrázku – jedná se o zobrazení začátku elektroferogramů jednoho identického  vzorku za použití dvou různých primerů – standardního primeru versus tag-modifikovaného primeru o stejné sekvenci. V případě tag-modifikovaných primerů lze dobře vidět výrazně kvalitnější čtení začátku sekvence. Obrázek hovoří sám za sebe.

Příklad 1, nahoře standardní, dole tagovaný primer:

Příklad 2, nahoře standardní, dole tagovaný primer:

Pozn. Číslování bazí na obrázcích je uměle posunuto, aby byl vidět náběh signálu.

Pakliže byste měli o sekvenování pomocí tag-modifikovaných primerů zájem, prosíme, kontaktujte nás.

Sanger lab, info@seqme.eu