Viděli jste někdy Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR systém? Pokud jste nevěděli, na co se vlastně díváte, asi se vám nelíbil. Podle mého názoru je to ten nejošklivější qPCR přístroj, jaký kdy byl vyroben, šedý, velký, těžký a hlučný. Dnes navíc i starý a pomalu vyřazovaný z qPCR laboratoří na celém světě. Ale je také nejlepší a to počítám i všechny nové, krásné, barevné přístroje s displeji a dalšími atraktivními a zbytečnými funkcemi. Pokud tento přístroj stále vlastníte, radím držet se ho zuby nehty. Proč?

Přesnost vašich Cq hodnot závisí na přesnosti měření fluorescence. Pokud měříte několik barev najednou, například FAM, JOE a TAMRA (nebo jakoukoliv jinou kombinaci), nevyhnete se překryvu jejich spekter:

A to je také nejsložitější úkol algoritmů každého přístroje – dobře rozlišit signály použitých barev. Jednoduše řečeno, jak změříte signál FAMu v duplexní qPCR, když se jeho spektrum překrývá se spektrem barvy JOE? Většina výrobců qPCR cyklerů používá emisní filtry a “vysekne” střední část spektra FAMu. Ale k přesnosti to má daleko a navíc to vede ke ztrátě citlivosti. Jenže je to jednoduché, v dnešní době tento způsob využívají téměř všechny qPCR přístroje.

A jsme zpátky u starého dobrého ABI 7900HT. Ten žádné filtry nemá! CCD kamera funguje jako spektrograf a kontinuálně snímá signál v rozsahu od 500 do 650 nm. Žádné vysekávání, žádná ztráta citlivosti, snímáte celé spektrum všech barev zleva doprava. Je to jediný qPCR přístroj svého druhu, který kdy byl vyroben. Spektrograf pochopitelně nevyřeší problém s překryvem barev, v zásadě ho dokonce zesílí, ale překryv je eliminován později během analýzy dat, za použití procedury nazývané kalibrace barev (pure dye calibration), což je součást pravidelné údržby ABI 7900HT, kterou provádějí uživatelé přístroje (typicky dvakrát ročně, případně provádíme my během servisní prohlídky). Mimochodem, pokud přemýšlíte, proč firma Applied Biosystems nepoužila spektrograf ve ViiA7 nebo QuantStudiu, jde o peníze, spektrograf je drahé řešení.

Shrnuto a podtrženo, ABI 7900HT je velmi citlivý a nejpřesnější a pokud vám ve vašich qPCR experimentech nezáleží na citlivosti a přesnosti, tak na čem tedy?