Aplikace
Technologie Illumina je tzv. technologie krátkých readů. Je to technologie volby pokud chcete například analyzovat změny genové exprese, detekovat varianty v (cílových oblastech) genomu nebo exomu nebo provádět spíše mělký než hluboký screening společenstev různých organismů včetně jejich funkčních genů. A samozřejmě v dalších scénářích. Nicméně pro celou řadu aplikací může být vhodnější technologie dlouhých readů Oxford Nanopore.
V oblasti sekvenování technologií Illumina nabízíme:
- Všechny dílčí kroky nutné pro úspěch vašeho projektu, počínaje poradenstvím při jeho designu, přes izolaci DNA/RNA, přípravu sekvenačních knihoven a vlastní sekvenování na nejmodernějších přístrojích až po analýzu a interpretaci dat.
- Řešení pro velké i malé projekty NGS - datové balíčky ShareSeq
- Přísnou kontrolu kvality na úrovni vzorku, knihoven a dat
- On-line systém objednávání, sledování výsledků a doručování dat - vše k dispozici 24/7
- Kurzy nebo workshopy, také přizpůsobené potřebám vašeho týmu
Přehled služeb:
Na sekvenátorech Illumina nabízíme pro zpracování vašich vzorků tyto možnosti:
| Objednáváte | Sekvenační dráhu nebo flowcellu | ShareSeq datový balíček |
| Na co je služba vhodná | Spíše větší projekty s nižší cenou na datovou jednotku (např. na jeden milión readů) | Spíše menší až střední projekty s nižší celkovou cenou |
| Dostupná sekvenační nastavení | Paired-end 150b, Paired-end 250b | |
| Kapacita | Od 375 Gb dat výše | Od 1 Gb dat výše |
| Záruka | Objem dat, která můžete očekávat, je určen přibližně. Většinou dodáváme větší objemy, než je uvedeno ve specifikacích. | Pokud připravujeme knihovny, pak garantujeme objem dat uvedený ve specifikacích ShareSeq datových balíčků! |
| Příprava knihoven | Náš tým nebo vy | |
| Typ knihoven | Bez omezení | |
| Adaptery | Kompatibilní se standardními sekvenačními primery Illumina. | |
| Indexy | Výhradně duální indexy. Pokud připravujete knihovny sami a nechcete/nemůžete použít duální indexy, vždy nás nejprve kontaktujte. | |
| Výstupy | Standardní (běžně používané formáty dat apod.). Pokud objednáváte dráhu nebo flowcellu, můžete od nás dostat i nedemultiplexovaná data, v případě balíčků ShareSeq to není možné. | |
Kdy využít celou dráhu / flowcellu a kdy využít ShareSeq datové balíčky?
Způsob zpracování vzorků je v obou případech totožný. Primárně jsou ShareSeq datové balíčky vhodné pro projekty malého až středního rozsahu, kdy je vyžadována poměrně nízká sekvenační kapacita na vzorek a nevyplatí se hradit sekvenování na celé dráze. Současně velmi doporučujeme ShareSeq i v případech, kdy provádíte velké a nákladné sekvenační projekty a chcete si předem něco otestovat - např. úspěšnost ribo-deplece či jiného způsobu nabohacení specifické frakce genomu/transkriptomu, míru mapování na referenční sekvenci, výskyt očekávaných organismů atp.
V případě datových balíčků ShareSeq budou vaše vzorky analyzovány společně se vzorky jiných klientů. Pokud provádíte sami přípravu knihoven, je naprosto kritické, abyste nám poskytli přesné informace o postupu přípravy, použitých indexech apod. Tyto informace budou požadovány při zadávání objednávky do našeho systému.
Výsledky, záruka a analýza dat
Získané sekvence budou roztříděny dle kombinace indexů do souborů reprezentujících jednotlivé vzorky a bude provedena analýza ukazatelů kvality sekvenace, jako je počet a délka sekvencí, phred score, %GC, úroveň duplikace atp. Jako výstup obdržíte data ve formátu FASTQ rozdělená do souborů dle jednotlivých vzorků. Tyto základní úkony analýzy jsou zahrnuty do služby Analýza dat Basic, která je povinnou součástí každé sekvenace.
U některých typů analýz, např. při sekvenování exomů, nabízíme standardní zpracování výsledků. Tato Analýza dat Advanced je zpoplatněna podle počtu vzorků a její objednání je volitelné. Pokud o ni nemáte zájem, obdržíte pouze FASTQ soubory (výše).
Jelikož každý sekvenační projekt má specifické požadavky stran analýzy dat, nabízíme analýzu dat dle vaší specifikace - Analýza dat Custom. Naši bioinformatici vám mohou pomoci s jakoukoliv analýzou dat. V případě, že máte o tuto službu zájem, je nutná individuální konzultace, ideálně již při přípravě projektu.
Níže uvádíme informace k několika vybraným aplikacím. Technologické spektrum sekvenátorů Illumina je velmi rozsáhlé, v případě jiných aplikací nás neváhejte kontaktovat.
Chcete-li analyzovat výskyt mikroorganizmů v určitém prostředí, je sekvenování metagenomu velmi efektivním nástrojem první volby. Nevýhodou technologie Illumina ve srovnání např. s technologií Oxford nanopore ale je nízké rozlišení. Zjednodušeně řečeno, Illumina umí identifikovat mikroorganizmy na úroveň rodu, Oxford Nanopore (a další technologie dlouhých readů) na úroveň druhu. Volba technologie je tedy dána cílem experimentu.
Nejčastěji používaná strategie je založena na sekvenování amplikonů získaných amplifikací vybraných genů (metagenomika dlouhých readů) nebo jejich hypervariabilních oblastí (metagenomika krátkých readů). Typicky se jedná o geny pro ribozomální podjednotky (jako 16S, 18S nebo ITS) ale zdaleka nejen o ně. Tyto geny nebo genové oblasti jsou již tradičně využívány k identifikaci organizmů na základě srovnání získaných sekvencí s referenčními databázemi.
Alternativním přístupem je shotgunové sekvenování celého vzorku případně metatranskriptomická analýza. V případě zájmu o tyto služby nás prosím kontaktujte.
Analýza metagenomu pomocí amplikonového sekvenování
| Rozlišení | Na úroveň rodu | Na úroveň druhu |
| Technologie | Illumina | Oxford Nanopore |
| Sekvenovaná oblast | Hypervariabilní úsek vybraného genu | Celý gen |
| Objem dat, který získáte | Od 20.000 readů/vzorek | Od 10.000 readů/vzorek |
| Doba zpracování | Asi 4 týdny | Asi 10 pracovních dnů |
Srovnání výstupů Illumina vs. Oxford Nanopore (ukázka): Technologií Illumina lze v uvedeném modelovém příkladu rozlišit pouze rod Bifidobacterium, technologií Oxford Nanopore lze určit jednotlivé druhy, např. Bifidobacterium breve atd.
Jaké cílové oblasti používáme pro taxonomickou analýzu?
Pro sekvenační taxonomickou analýzu lze použít různé hypervariabilní genové úseky. Primerové kombinace, které používáme pro amplifikaci, jsou průběžně doplňovány a nabídka je rozšiřována. Aktuální dostupné kombinace naleznete v Průvodním dokumentu, jehož vyplnění je povinnou součástí objednávky této služby.
Nenašli jste cílovou oblast, kterou potřebujete? - Kontaktujte nás!
Analýza datK laboratornímu zpracování vzorků lze současně objednat i analýzu dat, která využívá vhodné databáze a jejímž výsledkem jsou grafy taxonomických četností jednotlivých kategorií a jednotlivých vzorků. Výsledky budou zpracovány v přehledné formě (tabulky, grafy) a budou demonstrovat semikvantifikované zastoupení mikroorganismů. Máte-li již hrubá data k dispozici, můžete objednat jejich analýzu samostatně. |
 |
Analýza diferenciální genové exprese (DGE), je analýza rozdílů v četnosti výskytu genových transkriptů v transkriptomu podle fenotypu nebo experimentálních podmínek. Cílem analýzy diferenciální exprese je určit, které geny jsou odlišně exprimovány mezi porovnávanými podmínkami. Tyto geny mohou nabídnout biologický náhled na procesy ovlivněné podmínkami zájmu.
Protože počet genů, které jsou rozdílně exprimovány mezi vzorky, může být vysoký, je nutná metoda k pochopení a interpretaci významu tolika změn genové exprese. Metoda musí umožnit seskupení genů, které patří do konkrétní kategorie a mají odlišnou hladinu exprese v jednom vzorku ve srovnání s jiným vzorkem. Například pokud má vzorek rakoviny prsu odlišně než kontrolní vzorek exprimováno více genů, které jsou všechny anotovány jako „geny buněčného cyklu“. Seskupení genů lze provést na základě řady zdrojů, jedním z nich je Gene ontology databáze (GO).
Gene Ontology (GO) databáze je největším zdrojem informací o funkcích genů na světě. Tyto informace jsou dostupné/čitelné člověkem i strojově a tvoří základ pro výpočetní analýzu rozsáhlých molekulárně biologických a genetických experimentů v biomedicínském výzkumu. GO definuje pojmy / třídy používané k popisu funkce genů a vztahy mezi těmito pojmy.
Analýza DGE v naší laboratoři zahrnuje:
- Izolaci RNA
- Zpracování a sekvenování vzorků RNA
- Kontrola kvality hrubých dat, trimming bází s nízkou kvalitou a odstranění sekvencí adaptérů
- Mapování na referenční sekvenci (genom nebo transkriptom)
- Počítání readů + normalizace
- Analýza genové exprese pomocí balíčků DESeq2 a edgeR
- Genová anotace a analýza genové ontologie (GO)
- Vyhodnocení a shrnutí, zpráva o analýze dat
Pokud již máte nezpracovaná data od jiného poskytovatele sekvenačních služeb a potřebujete pouze pomoci s jejich analýzou, jsme vám také k dispozici.
Analýza dat - Výstupy (eng):
- Trimmed data in fastq format, multiqc report
- Aligned data in bam format, qualimap reports
- Matrix table with transcripts abundance
- Rescaled data according to the TMM normalization factors
- Expression values for all transcripts
- Volcano and MA plot in pdf format
- Count of differentially expressed genes
- Correlation heat map of each samples in pdf format
- Heat map of differentially expressed genes
- GO terms table + graphical output, web link to GO results
Pokud hledáte opravdu levnou možnost jak sekvenovat stovky nebo tisíce fragmentů DNA najednou, je Paralelní sekvenování amplikonů tou pravou volbou. Ačkoli název zmiňuje amplikony, je tato strategie obecně vhodná pro libovolné fragmenty dsDNA. Dodané fragmenty DNA musí v každém případě nést specifické přesahy, jak je uvedeno v Pokynech pro přípravu vzorků. Tento přístup ponechává počáteční přípravu vzorku pod vaší plnou kontrolou, což vám umožní cílit na oblasti vašeho zájmu a současně pracovat s reagenciemi dle vašeho výběru, ale bez nutnosti nákupu velkého počtu indexovaných adaptérů.
Příklad projektu paralelního sekvenování amplikonů - tři vzorky (pooly) obsahující 5 amplikonů každý (vlevo) nebo sofistikovanější design, kdy je poolováno 15 amplikonů do jednoho vzorku (vpravo). Obsahuje-li knihovna např. 94 vzorků, lze takto sekvenovat 470 (vlevo) nebo 1410 (vpravo) amplikonů. Data jsou při dodání demultiplexována na jednotlivé vzorky (94 souborů). Další rozlišení probíhá podle délky produktu, sekvence primerů případně jiných použitých identifikátorů.
Provedení
Krok 1 ve vaší laboratoři - Provedete PCR amplifikaci cílových oblastí a smíchání všech amplikonů ze stejného vzorku do jednoho poolu. Krok 2 v SEQme laboratoři - Provedeme druhou PCR, v níž k vašim amplikonům přidáme indexy a sekvenační adaptéry. Takto zpracované vzorky jsou následně sekvenovány podle vašich požadavků - služba je z hlediska výstupu flexibilní.
Sekvence primerů a návod na provedení prvního kroku analýzy najdete zde.
Standardně nabízíme celoexomové sekvenování vzorků lidské a myší DNA, pro jiné organismy nás v případě zájmu kontaktujte.
Celoexomové sekvenování (whole-exome sequencing, WES) je nejúčinnějším způsobem studia kódujících oblastí genomu. V naší sekvenační laboratoři používáme technologii hybridizace sond vyvinutou společností Agilent Technologies, Inc., která se ukázala jako velmi efektivní a spolehlivá.
Systém obohacení SureSelect XT HS (Agilent Technologies) využívá RNA sondy k hybridizaci na cílové oblasti DNA. Hlavní výhody této technologie jsou:
- Hybridizace RNA:DNA je účinnější než hybridizace DNA:DNA využívaná jinými systémy dostupnými na trhu
- Sekvenační knihovny mohou být generovány i pro DNA získanou z FFPE vzorků
- Systém má vynikající uniformitu.
- Pokrytí napříč referenční sekvencí: 99,6% (známé geny CCDS a UCSC)
