Technologie sekvenování Oxford Nanopore (ONT) je tzv. technologie dlouhých readů. Je určena pro skládání genomů, hledání transgenů, analýzu počtu kopií nebo repetitivních oblastí případně screening společenstev různých organismů. Klíčovým rozdílem vůči technologii sekvenování krátkého čtení Illumina je samozřejmě délka. Sekvenování pomocí nanoporů může produkovat ready (sekvence) o délce až stovky kilobází, zatímco Illumina je omezena na stovky bází. Tento několikařádový rozdíl je pro zmíněné i další aplikace zásadní.
Sekvenování technologií Oxford Nanopore
Seznamte se s budoucností teď. Objevte novou generaci technologie molekulárního snímání, která nabízí krátké až ultra dlouhé nativní čtení DNA a RNA.
- Všechny dílčí kroky nutné pro úspěch vašeho projektu, počínaje poradenstvím při jeho designu, přes izolaci DNA/RNA, přípravu sekvenačních knihoven a vlastní sekvenování na nejmodernějších přístrojích až po analýzu dat.
- Řešení pro velké i malé projekty NGS, protože variabilní design flow cell používaných v sekvenátorech Nanopore umožňuje skvělou škálovatelnost.
- Přísná kontrola kvality na úrovni vzorku, knihoven a dat
- On-line systém objednávání, sledování výsledků a doručování dat - vše k dispozici 24/7
- Kurzy nebo workshopy, také přizpůsobené potřebám vašeho týmu
Níže uvádíme informace k několika vybraným aplikacím. Technologické spektrum sekvenátorů Oxford Nanopore je velmi rozsáhlé, v případě jiných aplikací nás neváhejte kontaktovat.
Při identifikaci některých organizmů, např. mikroorganizmů v komplexních komunitách, je amplikonové sekvenování na bázi short readů Illumina nedostatečné a je třeba sekvenovat delší úseky DNA. Typickým příkladem je sekvenování celého 16S rRNA genu, ITS oblasti apod. Pro tento přístup je mimořádně vhodná technologie Oxford Nanopore. Technologicky se jedná o obdobu jakéhokoliv amplikonového sekvenování. Celý proces pro vás zajistíme na klíč včetně long-range PCR na vámi dodané gDNA.
Srovnání výstupů Illumina vs. Oxford Nanopore (ukázka): Technologií Illumina lze v uvedeném modelovém příkladu rozlišit pouze rod Bifidobacterium, technologií Oxford Nanopore lze určit jednotlivé druhy, např. Bifidobacterium breve atd.
Jaké cílové oblasti používáme pro taxonomickou analýzu? Pro sekvenační taxonomickou analýzu lze použít různé geny nebo cílové oblasti. Primerové kombinace, které používáme pro amplifikaci, jsou průběžně doplňovány a nabídka je rozšiřována. Aktuální dostupné kombinace naleznete zde.
ONT technologie je naprosto klíčová při sestavování nových genomů, což je bioinformatický proces, v němž jsou skládány dlouhé nebo krátké (nebo oba) typy readů. Lze jej připodobnit ke skládání puzzle, kdy dlouhé ONT fragmenty DNA lze podstatně snáze sestavit do úplné sekvence DNA jednoduše proto, že jsou delší, stejně jako se snáze skládá puzzle s méně velkými dílky.
Díky tomu je sekvenování s dlouhým čtením technologií primární volby pro skládání genomů. Z řady důvodů je však ideální scénář kombinace dlouhých readů ONT s krátkými ready Illumina. Přečtěte si o sestavení genomu pomocí dat z technologií Oxford Nanopore a Illumina! Projekty tohoto typu typicky vyžadují individuální konzultaci.
Transgenní organismy (a zejména myši) jsou kritickým nástrojem in vivo modelování.
Transgenní technika, kdy je exogenní gen vložen do myšího genomu přímou injekcí DNA do zygoty, umožnila vytvoření tisíců nových transgenních linií. Technika však není bez omezení. Jednou z jejích největších nevýhod je, že integrace transgenu je náhodná událost.
Jenže bez znalosti toho, kde k integraci dochází, nelze zcela předvídat důsledky dané genetické modifikace. Inzerce transgenu může narušit regulační nebo kódující oblast kritického genu, často se jako konkatemery vkládá více kopií transgenu, což vede k variabilitě počtu kopií, případně mohou různá místa, v nichž dochází k integrační události, mít za následek mozaikové vzory exprese transgenu (polohový efekt). Je tedy velmi důležité znát přesné místo integrace transgenu.
K mapování míst vložení lze použít metody založené na sekvenování nové generace (NGS), ale „standardní“ NGS technologie Illumina nemůže tomuto účelu spolehlivě sloužit.
V naší laboratoři jsme například odhalili umístění transgenu na myším X chromozómu v počtu 18 kopií za sebou (a jedné neúplné), přičemž celková délka analyzované oblasti byla asi 80 kilobází. Takováto analýza je zcela mimo možnosti jakékoliv technologie short-readů:
Dlouhé čtení technologie Oxford Nanopore však nejenže umožňuje lokalizovat transgen(y), ale současně:
- Poskytuje informaci o počtu kopií transgenu
- Poskytuje přímý důkaz o inverzích transgenu
- Odhalí kontaminující genomickou DNA E. coli
- Validuje integritu sousedních genů
Pozn.: Podobně jako u sestavování genomu může být kombinace technologie ONT s krátkým čtením Illumina vhodným řešením v závislosti na konkrétním scénáři. Projekty tohoto typ typicky vyžadují individuální konzultaci.