Aneb jak sekvenovat stovky nebo tisíce amplikonů vašeho zájmu najednou (Tailed-amplicon library)
Tři vzorky (pooly) obsahující 5 amplikonů každý (vlevo) nebo sofistikovanější design, kdy je poolováno 15 amplikonů do jednoho vzorku (vpravo). Obsahuje-li knihovna např. 94 vzorků, lze takto sekvenovat 470 (vlevo) nebo 1410 (vpravo) amplikonů. Data jsou při dodání demultiplexována na jednotlivé vzorky (94 souborů). Další rozlišení probíhá podle délky produktu, sekvence primerů případně jiných použitých identifikátorů. Obrázek poskytl p. Luis Perera Fernández.
Pokud hledáte opravdu levnou možnost jak sekvenovat stovky nebo dokonce tisíce fragmentů DNA najednou, je sekvenování strategií Tailed Amplicon tou pravou volbou. Ačkoli název zmiňuje amplikony, je tato strategie obecně vhodná pro libovolné fragmenty dsDNA nesoucí specifické přesahy na obou koncích (5´ a 3´), které nemusí být získány výhradně pomocí PCR. Ve skutečnosti je kompatibilní s fragmenty DNA získanými štěpením tagmentázou (Illumina Tagment DNA TDE1 Enzyme) nebo fragmenty DNA, kterým jsou specifické přesahy ligovány. Dodané fragmenty DNA musí v každém případě nést specifické přesahy, jak je uvedeno níže! Proč? Protože v naší sekvenční laboratoři jsou tyto specifické přesahy využívány k přidání další sady přesahů (adaptérů) potřebných pro sekvenování, včetně potřebných sekvenačních indexů. To umožňuje vysokou úroveň multiplexování. Tento přístup ponechává počáteční přípravu vzorku pod vaší plnou kontrolou, což vám umožní cílit na oblasti vašeho zájmu a současně pracovat s reagenciemi dle vašeho výběru, ale bez nutnosti nákupu velkého počtu indexovaných adaptérů. Místo vás je dodáváme my a připravujeme sekvenační knihovnu pro následné sekvenování pomocí jakékoli platformy Illumina v naší nabídce. |
Krok 1 ve VAŠÍ laboratoři - Provedete PCR amplifikaci cílových oblastí a smíchání všech amplikonů ze stejného vzorku do jednoho poolu. Například, pokud máte 94 vzorků a 5 různých amplikonů na vzorek, provedete 5 x 94 PCR reakcí a smícháte amplikony pro každý vzorek dohromady. Vzorky je dále potřeba přečistit a naředit na jednotnou koncentraci dle platných Pokynů pro přípravu vzorků.
Krok 2 v SEQme NGS laboratoři - Provedeme druhou PCR, v níž k vašim amplikonům přidáme indexy a sekvenační adaptéry, provedeme kontrolu kvality takto zpracovaných vzorků a spojíme všech 94 vzorků do jediné knihovny pro vlastní sekvenování.
Připojte na 5’ konce vašich primerů:
První krok PCR provedete pomocí primerů výše. V naší laboratoři pak budou vaše vzorky zpracovány následovně:
Asi 4 týdny (nezahrnuje analýzu dat)
Dodržujte naše Pokyny pro přípravu vzorků.
Analýzu lze objednat jako balíček pro 24, 48, 94 nebo 190 vzorků. Chcete-li objednat analýzu jiného počtu vzorků (např. jen několik málo vzorků nebo naopak tisíce), kontaktujte nás pro vypracování individuální kalkulace.