Na kvalitu výstupu sekvenátorů Oxford nanopore nemá vliv velikost fragmentů ani nedochází například k preferenčnímu loadingu krátkých fragmentů apod. Na druhou stranu je tato technologie velmi citlivá na přítomnost jakýchkoliv inhibitorů, jejichž vliv na aktivitu nanoporů může významně snížit množství dat. Doporučujeme pečlivě kontrolovat přítomnost jakýchkoliv inhibitorů.

Pokud se vám nedaří některých inhibitorů zbavit, můžeme připravit knihovnu z malého množství templátu pomocí několika PCR cyklů, inhibitory se naředí a následuje dodatečná purifikace. Doporučujeme rovněž vzorky ihned po izolaci zamrazit a cykly rozmražování / zamražování neopakovat.

Pozn. Pro metagenomické analýzy založené na sekvenování dlouhých amplikonů (např. 16S) lze gDNA připravit běžným způsobem jako v případě technologie Illumina. Důležité je, aby DNA byla prostá inhibitorů PCR reakce.

Pokyny uvedené níže jsou podmínkou dosažení nejlepšího výsledku sekvenace:

• Dodržujte naše Pokyny pro přípravu vzorků.
• Pokud můžete použít některou z klasických metod izolace HMW DNA, použijte ji a vyhněte se komerčním kitům. Případně se inspirujte zde.
• Požívejte špičky s širokým otvorem.
• DNA musí být dvojřetězcová, jednořetězcové templáty interferují při kvantifikaci a při vazbě polymerázy. Ošetřete vzorky RNázou, abyste se zbavili RNA.
• Nevortexujte DNA, i když je to v protokolu napsáno.
• Pokud DNA přečišťujete na magnetických částicích, pipetujte velmi jemně a přidejte dodatečnou inkubaci při vazbě a eluci DNA na/z částic. Ujistěte se, že ve vzorku nezůstal zbytek těchto částic, mohly by působit inhibičně.
• Vzorky by měly být eluovány do pufrů podobného složení jako v sadách Qiagen (10 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8.5). Po izolaci gDNA je potřeba minimalizovat počet cyklů zamražení a tání.
• Nevystavujte vzorky interkalačním barvivům, UV záření, teplotám vyšším než 65°C na dobu delší než 1h a extrémním pH (<6 nebo >9).
• Ujistěte se, že vzorky neobsahují nerozpustné kontaminanty a že vzorek není zabarven, či kalný. Vyvarujte se přenosu kontaminantů ze zdrojového organismu (např. hem, huminové kyseliny, polyfenoly, apod.), chelatačních činidel (jako je např. EDTA >0,1 mM), detergentů (jako SDS, Triton-X100), denaturačních činidel (jako guanidinové soli, fenol) nebo divalentních kationtů kovů (jako Mg ²⁺).
• Vzorky musí mít poměr OD₂₆₀/OD₂₈₀ v rozmezí 1.8 až 2.0 a OD₂₆₀/OD₂₃₀ v rozmezí 2.0 až 2.2.
• Na závěr proveďte analýzu na gelu či přístroji pro kapilární elektroforézu (např. Agilent Bioanalyzer). Pokud Vám vzorek připadá degradovaný, proveďte znovu extrakci nebo přečištění.

Poznámky: