Jedním z častých problémů při Sangerově sekvenování jsou vzorky s vysokým obsahem solí. V obecné rovině by člověk mohl mluvit o inhibitorech jako takových, ale sole jsou asi nejčastější případ. Pokud nám takovéto vzorky zasíláte, pravděpodobně nebudete příliš spokojeni s kvalitou výsledku. V tomto článku se podíváme blíže na to, proč tomu tak je, a hlavně, co se s tím dá dělat.
Sangerovo sekvenování je spojeno s určitými technickými limitacemi a jedna z těch zásadních je délka čtení. Typicky nelze očekávat – a to ani při naprosto bezchybném provedení – delší čtení než zhruba nějakých 1100 bází. Jaký je však spodní limit, jak dlouhé nebo spíše krátké templáty mohou být, abychom je dokázali úspěšně sekvenovat? A můžeme sekvenovat od první báze za sekvenačním primerem? V tomto článku se na tento problém podíváme.
Při sekvenování PCR produktů někdy dochází k tomu, že fluorescenční signál prudce poklesne a sekvence PCR produktu se nepřečte celá. Typickou příčinou tohoto problému je přítomnost různých inhibitorů v templátech sekvenační reakce.
Podobně jako asi málokdo vyrazí do divadla či na sportovní zápas, aniž by věděl, co je na programu nebo kdo proti komu hraje, i v případě objednání různorodých služeb je normální mít předem alespoň trochu představu, co od poskytovatele dané služby mohu čekat. Od konkrétních požadavků se přirozeně odvíjí to, jak KVALITNĚ, RYCHLE a ZA JAKOU CENU danou službu mohu získat, což samozřejmě platí i v oblasti DNA sekvenování. Je pochopitelné, že většina klientů by byla ráda, aby byla všechna tato tři kritéria splněna současně na 100 %, ale naprosto otevřeně říkáme, že to není v podstatě možné.
Správná (a dostatečná) koncentrace templátu je pro úspěch sekvenačních analýz naprosto zásadním parametrem. Pokud nemáte požadované množství templátu k dispozici, můžete snížit celkový objem zasílaných vzorků při dodržení koncentrace templátu i primeru. Navýšení objemu vzorku při zachování nízké koncentrace není řešením...
Zcela běžnou součástí sekvenačního elektroferogramu je kvalitativně zhoršený (respektive nečitelný) úplný začátek sekvence. První očekávanou zobrazitelnou bází by teoreticky mohla být první báze za sekvenačním primerem. Ve skutečnosti však zpravidla přibližně 20 bází za primerem nelze spolehlivě přečíst ...
Jedním z občas se objevujících požadavků je i dotaz na přímou sekvenaci velkých templátů, např. chromozomální DNA, BAC vektory, kosmidy apod. V principu to možné je, ale stejně jako u standardních reakcí, kdy je templátem krátký pcr produkt nebo plazmid, je i zde potřeba dodržet jeden základní požadavek, kterým je správné množství templátu.
Výsledky Sangerova sekvenování jsou poskytovány ve třech typech souborů a ne každý uživatel tuší, jaké možnosti jednotlivé soubory poskytují a jak s nimi efektivně pracovat. Sepsali jsme pro tyto účely stručný návod.
Objednali jste si sekvenační analýzu DNA zaklonované do plazmidového vektoru či PCR produktu a výsledná sekvence je ukončena dříve než jste očekávali? Jednou z možných příčin může být skutečnost, že v templátu dochází ke vzniku sekundární struktury, nejčastěji vlásenky.
Takže řekněme, že máme dobré a stabilní signály, délka čtení je také v pořádku, takže jsme úspěšně překonali všechny trable zmíněné v prvních dvou částech tohoto textu, ale pořád můžeme být daleko od dobrého výsledku sekvenace. Třetí a poslední část je věnována situaci, že se píky vzájemně překrývají. Sekvence je nečitelná.
V první kapitole jsme se věnovali problémům s žádným nebo velmi slabým fluorescenčním signálem. Bylo to v zásadě o prázdných elektroferogramech. Velmi frustrující záležitost. Teď pokročíme k další jen o málo menší nepříjemnosti – v reakcích pozorujeme nějaký signál, ale výška píků rychle klesá. Délka čtení je velmi krátká.
Cílem tohoto textu není detailní rozbor všech problémů, na které můžete narazit při vyhodnocování vašich výsledků. Ani by to nemělo smysl, protože jich je příliš mnoho. Naštěstí naprostá většina chybných výsledků vzniká v důsledku několika málo „základních“ chyb, jejichž odstranění není ve většině případů nijak složité, a na ty se zaměříme. Nebudeme se zabývat problémy vzniklými v důsledku chyb hardwaru (sekvenátorů) ani sekvenačních reagencií používaných v naší nebo kterékoliv jiné sekvenační laboratoři, jednoduše proto, že jako uživatelé je stejně nemůžete ovlivnit a je naší zodpovědností dodat vám výsledky v takové kvalitě, abyste tyto potíže ani nezaznamenali.
Při přečišťování templátů pro DNA sekvenování (plazmidů nebo PCR produktů) se často využívají centrifugační kolonky v nichž je DNA navázána na silica matrici. Bohužel některé kolonky (i renomovaných výrobců!) mají takový tvar, že spíše než k přečištění dojde k znečištění templátu.
